為什么新guan病毒不能只檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)

目前，市面上常見(jiàn)的新guan病毒檢測(cè)靶點(diǎn)為ORF1ab和N基因或E基因。

但據(jù)WHO的相關(guān)文件，隨著疫情的進(jìn)行，新guan病毒的靶點(diǎn)序列可能會(huì)產(chǎn)生突變，從而導(dǎo)致引物/探針無(wú)法與目的序列結(jié)合，導(dǎo)致假陰性。因此WHO建議檢測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)。

以往上建議篩查時(shí)先檢測(cè)E基因（包膜基因），在確證時(shí)檢測(cè)RdRp基因（即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因），該基因有助于辨別新guan與其他冠狀病毒^{【1】【2】}。

參考文獻(xiàn)：

1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 

  2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

下面筆者即來(lái)介紹這款新guan病毒引物/探針。

一、用途：

新guan病毒RT-qPCR引物/探針（套裝）（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測(cè)和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究，不用于臨床診斷。

二、描述：

  1. 該產(chǎn)品包括三個(gè)小管：

     ①橙蓋： 2019-nCoV Mix（凍干粉），1管。此管即新guan病毒引物/探針，可特異性擴(kuò)增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會(huì)被檢測(cè)到。（該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實(shí)驗(yàn)室公布的新guan病毒引物/探針序列而設(shè)計(jì)）。

     ②綠蓋：Positive Control RNA（陽(yáng)性對(duì)照RNA，凍干粉），1管。

    此陽(yáng)性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。

     ③白蓋：PCR Grade Water（液體），1管。

  2.使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級(jí)水（③白蓋）復(fù)溶，并分裝，避免反復(fù)凍融。

  3.該引物/探針應(yīng)與MB公司提供的【RNA病毒檢測(cè)試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,貨號(hào)192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反應(yīng)檢測(cè)。

  4．檢測(cè)樣本需為抽提過(guò)的RNA樣本。

  5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測(cè)，擴(kuò)增的人RNA酶P基因（過(guò)程對(duì)照）用ROX™通道檢測(cè)，用以評(píng)估樣本的制備質(zhì)量。

三、產(chǎn)品特點(diǎn)：

  1. 靶點(diǎn)特別。依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，此引物探針為新guan病毒RdRp基因，而非市面上常見(jiàn)的ORF1ab和N基因或E基因。

  2.陽(yáng)性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。

  3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，性能穩(wěn)定。

  4. 適用于科研中，各種來(lái)源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌等。

四：使用：

RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl反應(yīng)體積）

（1）1個(gè)反應(yīng)需要加入：

酶預(yù)混液 （RT-qPCR mix）10μl ，

橙蓋（復(fù)溶的2019-nCoVMix引物/探針）5μl

（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

設(shè)置qPCR程序

1個(gè)循環(huán)：55 ℃，10分鐘

1個(gè)循環(huán)：94 ℃，3 分鐘

45個(gè)循環(huán)：94 ℃，15秒

               58℃，30秒

終用FAM和ROX檢測(cè)。

更多參考文獻(xiàn)，請(qǐng)見(jiàn)：

1. Corman, V.M., et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill, 2020. 25(3).

2. LeBlanc, J.J., et al., Real-time PCR-based SARS-CoV-2 detection in Canadian Laboratories. J Clin Virol, 2020: p. 104433.

3. Uhteg, K., et al., Comparing the analytical performance of three SARS-CoV-2 molecular diagnostic assays. J Clin Virol, 2020. 127: p. 104384.

4. van Kasteren, P.B., et al., Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for. J Clin Virol, 2020. 128: p. 104412.

5. Lowe, C.F., et al., Detection of low levels of SARS-CoV-2 RNA from nasopharyngeal swabs using three commercial molecular assays. J Clin Virol, 2020. 128: p. 104387.

6. Igloi, Z., et al., Comparison of commercial realtime reverse transcription PCR assays for the detection of SARS-CoV-2. J Clin Virol, 2020. 129: p. 104510.